液相方法開發攻略 - 彈：實現保留
液相方法開發攻略
彈：實現保留
今天要為大家帶來一個新干貨系列——液相方法開發攻略！
在進行液相色譜分析時，我們通常有以下訴(su)求：
而在液相分析工作中，液相方法的開發一直是一項比較具有難度的工作，不論是新手小白，還是有經驗的實驗室老師，在面對新項目的方法(fa)開發時，總會遇到一些問題。
因此，YoYo特意把大曹三耀技術中心多年來積累總結的經驗，梳理匯總為這一系列液相方法開發攻略，并將(jiang)圍(wei)繞以下四個方面(mian)展開介紹：
★ 實(shi)現保留
★ 實現分離
★ 峰形和理論塔板數
★ 壽命
今天先來介紹重要也是關鍵的彈——實現保留，后(hou)續幾篇(pian)將在(zai)今后(hou)陸(lu)續推(tui)送(song)，敬請期待喲~
由(you)于大部分化合物都可以(yi)在反(fan)(fan)相(xiang)(xiang)分析(xi)模式下，使用反(fan)(fan)相(xiang)(xiang)C18色(se)(se)譜柱進行(xing)分析(xi)與保留，因此，在建立新方法時，反(fan)(fan)相(xiang)(xiang)C18色(se)(se)譜柱也是優先選擇的色(se)(se)譜柱。一般(ban)可以(yi)按照(zhao)以(yi)下步驟進行(xing)調(diao)整：
反相C18柱初篩 看是否有保留
提問：方(fang)法(fa)初(chu)篩時，選擇什么(me)樣(yang)的C18色譜柱比較好？
YoYo老師：選擇一款普適型色譜柱，要求硅膠純度高、金屬雜質低、具有適中(zhong)的(de)疏水性(xing)與表面極性(xing)，能分析大多數常規化合物，峰形好、壽命長，分(fen)離(li)度高，柱效高~
這些要求很過分(fen)嗎？不！
這是我們對CAPCELL PAK C18 MGII色譜柱的基本要求！
CAPCELL PAK C18 MGII
CAPCELL PAK C18 MG系列色譜柱憑借填料表面致密的聚合物包被技術，極大程度地抑制了硅膠基材的金屬雜(za)質及殘留(liu)硅醇基等不良影響，CAPCELL PAK系列色譜(pu)柱具(ju)有以下特長：
★ 極大限度地減少配位化合物的吸附
★ 極大限度地抑制殘留硅醇基的二次效應
★ 優越的耐酸、耐堿性能
★ 能得到對稱(cheng)性良(liang)好的色譜峰(feng)
★ 具(ju)備良好(hao)的保留(liu)與分(fen)離能力
其中，CAPCELL PAK C18 MGII色譜(pu)柱是普適性很強的C18色(se)譜柱，可以滿(man)足(zu)大部分化合物的分析需求。
那么(me)，在經過C18色譜柱(zhu)初(chu)篩之(zhi)后，還(huan)是發生了保留不充分的情況，應該(gai)如(ru)何調整分析(xi)方法來實現保留呢？
1
調整pH值
在反相模式下，對于不同性質的化合物也應采取不同的流動相條件及相應色譜柱。例如，酸性化合物在酸性條件下保留較強，堿性化合物在堿性條件下保留較強，利用這一性質，調整適合的pH值，并選擇(ze)相應適合的色譜(pu)柱，即可達到良好保留結果。
在設定流動相pH時需要注意：離子性化合物可能會由于流動相pH值設定的不合理而發生漂移，建議將流動(dong)相的pH值設定在(zai)化合物(wu)的pKa±2以上范圍。
2
更換保留模式
如果調整流動相pH也不能解決保留問題，該化合物可能不適合在反相模式下進行保留和分析，這時，可以考慮更換(huan)保留模(mo)式進(jin)行(xing)進(jin)一步(bu)的方法摸索。
★ 離子交換模式（離子對(dui)試劑、離子交換柱）
★ HILIC模式
★ 正(zheng)相模式
色譜柱的選擇
對于強極性、小分子類化合物，可以使用高極性反相柱或在HILIC模式下進行保留嘗試
★ 高(gao)極性反相(xiang)柱：AQ、ADME
★ HILIC（親水性相互(hu)作(zuo)用）柱：PC HILIC、NH2、SILICA
對于酸性化合物，可以使用陰離子交換柱或反相柱+正離子對試劑的方法，使酸性化合物處于分子態，利于增強保留
★ 陰離(li)子交換柱：NH2
★ 反相柱+正離子對(dui)試劑：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18
對于堿性化合物和兩性化合物，可以嘗試使用陽離子交換柱或反相柱+負離子對試劑的方法，使堿性化合物處于分子態，增強保留
★ 陽(yang)離子交換柱：SCX、CR
★ 反相柱+負離子(zi)對試劑：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18
分離模式選擇例
接下來，YoYo將以三聚氰胺的(de)分析為例，對保留困難的(de)化合物的(de)方法建立進行說明。
三聚氰(qing)胺(an)俗稱蜜胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，為重要的氮雜環有機化工原料，有毒，不可用作食品加工和食品添加劑，pKa=8，屬于弱堿性化合物(wu)。
三聚氰胺
Melamine
M.W. :126.12
（一）離子交換模式
在離子交換模(mo)式(shi)下(xia)進行分(fen)(fen)析，能(neng)對三(san)聚(ju)氰胺得(de)到良好保(bao)留。具體做法(fa)可分(fen)(fen)為以下(xia)兩種：
1. 反相色譜柱 + 離子對試劑
▲CAPCELL PAK C18 MG+離子(zi)對試劑
HPLC Conditions (Refer to GB/T 22388-2008):
Column: CAPCELL PAK C18 MG S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
M.Phase: 10 mM citric acid, 10mM SOS (pH 3.0 adjusted with NaOH) / CH3CN = 90 / 10
Flow rate: 1 mL/min
Oven Temp.: 40°C
Detector: UV 240 nm
Sample: Melamine in M.P.
Inj. Vol.: 20 μL
2. 離子交換色譜柱分析
▲CAPCELL PAK SCX色譜柱
HPLC Conditions:
Column: CAPCELL PAK SCX UG80 S5; 4.6 mm i.d. × 150 mm
M.Phase: 50 mM KH2PO4 (pH 3.0 adjusted with H3PO4) / CH3CN = 70 / 30
Flow rate: 1 mL/min
Oven Temp.: 30°C
Detector: UV 240 nm
Sample: Melamine in M.P.
Inj. Vol.: 20 μL
CAPCELL PAK SCX
CAPCELL PAK SCX是一款解決了傳統硅膠系離子交換柱存在的問題的聚合物包(bao)被型強陽(yang)離子(zi)交換色譜柱。在精密分級的5 μm的高純度硅膠上形成高分子聚合物包被后，導入磺酸基。聚合物包被型的Si-C結合比一般的化學結合型硅膠系SCX的Si-O-Si結合更穩定，耐久性更強。
★ 通過(guo)強陽離子交換作(zuo)(zuo)用和疏(shu)水性相互作(zuo)(zuo)用的(de)共同(tong)保留機制來進(jin)行保留
★ 批次間重(zhong)現性良好(hao)
★ 耐久(jiu)性強(qiang)
不論是反相(xiang)柱+離(li)子(zi)對試劑，還是使用離(li)子交換(huan)色譜柱進行分析，都會發現色譜柱平衡時間對保留時間的影響。在離子交換模式下進行分析時，需要充分(fen)平衡(heng)色譜柱，建議小流(liu)速過夜平衡(heng)，可以得(de)到比較穩定的實驗結果。
（二）高極性反相色譜柱
鍵合金剛烷基團的CAPCELL PAK ADME色譜柱，兼具高表面極性和一定的疏水性，不僅適用于強極性物(wu)質的(de)保(bao)留，也適用于強(qiang)極(ji)性物質(zhi)和疏水性物質(zhi)的(de)多組分(fen)共同分(fen)析。
使用鍵合*金剛烷基團的CAPCELL PAK ADME色譜柱，在簡單的2%甲醇條件(jian)下即可實(shi)現三聚氰胺和雙氰胺的良好保留與分離。這得益于ADME色(se)譜柱*的表(biao)面極性(xing)與保(bao)留模式。
▲CAPCELL PAK ADME分(fen)析三(san)聚氰胺與雙氰胺結(jie)果
*峰(feng)(feng)1：雙(shuang)氰(qing)胺，峰(feng)(feng)2：三(san)聚(ju)氰(qing)胺
HPLC Conditions:
色譜柱：CAPCELL PAK ADME S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
流動相：2% CH3OH
流 速：1000µL / min
溫 度：35°C
檢 測：PDA210 nm
進樣量：5 µL
樣 品：10 μg/mL（流(liu)動相溶解稀(xi)釋）
CAPCELL PAK ADME
CAPCELL PAK ADME色譜(pu)柱(zhu)采用*的立體籠狀金剛烷基官能團(tuan)——ADME官能團(tuan)，突破了以C18官能團為主的傳統柱在反相保留機理中的可分析化合物的限制，使可分析化合物的極性范圍得到了巨大的(de)提升；并且，在極性提升的同時還兼顧一定的(de)疏水性；從而，包含從強極(ji)性化(hua)合物到疏水性化(hua)合物的復雜組分樣品在ADME上也能同時(shi)得到良好的保留。
★ 立體籠狀金剛烷基官能團——*的*的表面極性與疏水性平衡
★ 高表面極性——對強極性化合物的良好保留
★ 兼顧一定疏水性——從極性到疏水性化合物的共同分析
★ 立體選擇性——空間異構體拆分能力
ADME(adamantane)金剛烷，我們將這種籠狀結構的金剛烷基團以控制的鍵合密度導入填料表面，通過“新型官能團”和*的包被型填料表面“控制技術”，我們將保持(chi)疏水(shui)性又提高表面(mian)極性變為可能；由于金剛烷*的籠狀結構所帶來的立體選擇性，還賦予了ADME分離結構(gou)類似化(hua)合物的能力。
（三）親水性相互作用 HILIC模式
親水性相互作用色(se)譜法(fa)（HILIC）是針對在常規C18色譜柱上保留較弱的強(qiang)親水性(xing)物質的保留方法。在HILIC模式下，通過鍵(jian)合極性(xing)官(guan)能團的固(gu)定相與反相模式常用的CH3CN / H2O系流(liu)動相條件相組合，對親水性化合物進行保留與分離。因此，HILIC是在HPLC的分離模式中常使用的反相模式的反相，故也被稱為“反(fan)反(fan)相(xiang)模式(shi)”。
大阪曹達獨立研發合成了構成細胞膜的主要(yao)磷脂類物質之一的卵磷脂親水性部位(wei)——PC基(ji)團（磷酸膽堿基(ji)團），作為PC HILIC色譜柱的官能團，對(dui)親水性化合物的保(bao)留(liu)具有優勢。
如下圖，使用PC HILIC色譜柱和另一款其他品牌色譜柱Column B進行對比，對三聚氰胺進行分析，在10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10（pH = 3.0）條件下，PC HILIC色譜柱(zhu)所得保留(liu)時間更(geng)長，理論塔板(ban)數更(geng)高，即使是在水相比(bi)例為(wei)20%時，也(ye)得到(dao)了足夠的保(bao)留(liu)。
▲PC HILIC色譜柱在不同條件(jian)下分析(xi)結果
HPLC Conditions：
Column : PC HILIC 4.6 mm i.d. x 250 mm
Mobile phase : 10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10, pH = 3.0
Flow rate : 1.0 mL/min
Temperature : 40 ?C
Detection : UV 235 nm
Inj. vol. : 10 μL
Sample dissolved in: Mobile phase
PC HILIC
大阪曹達獨立研發合成了構(gou)成(cheng)細胞(bao)膜(mo)的(de)主要(yao)磷(lin)脂類物(wu)質之一的(de)卵(luan)磷(lin)脂親水性(xing)部位——PC基團(tuan)(tuan)（磷(lin)酸膽堿基團(tuan)(tuan)），作為PC HILIC色譜柱的官能團(tuan)，對親(qin)水性化合物的保留具有優(you)勢。
★使用超親水性的磷酸膽堿基團作為官能團的HILIC色譜柱
★隨乙腈含量增加，保留增大，通常70%乙腈
（四）LC-MS分析——混合模式保留
MS檢測對流動相的要(yao)求：
★ 不含離子對試劑
★ 揮發性鹽，低濃度
陽離子交(jiao)換填料柱 + 揮發性鹽溶液（低濃度）
SCX + C18 = CR ！
在以MS檢測器進行分析時，流動相條件會對靈敏度產生很大影響，CAPCELL PAK CR色譜柱(zhu)混合了C18和強陽離子交換SCX填料，即使對多種堿性化合物進行同時分析，也能兼顧(gu)對保留和MS檢測靈敏度(du)的(de)要求。
如上圖，在中(zhong)性條件下：
● C18色譜柱：中性(xing)化(hua)合物得到保留，酸性(xing)、堿(jian)性(xing)化(hua)合物快速出峰；
● SCX色譜柱：堿性化(hua)合物得到保留，中性、酸(suan)性化(hua)合物快速出峰(feng)；
● 混合了兩種填料的CR色譜柱：堿性化合物得到保留，中性化合物能得到適度保留，酸性化合物依然快速出峰。
此時，只需將流動相條件調整為酸(suan)性(xing)，即可在CR色譜柱上(shang)同時(shi)保留(liu)這三種類型的化合物：
HPLC Conditions：
Column ：CAPCELL PAK CR S5 1:4 ; 2.0 mm i.d. × 150 mm
Mobile Phase：1.0 vol% CH3COOH,
25 mmol/L CH3COONH4 / CH3CN = 50 / 50
Flow rate ：200 µL/min
Temp ：40 ℃
Detection ：UV 240 nm
Injection ：2 µL
Sample ：10 µg/mL
CAPCELL PAK CR
CAPCELL PAK CR色譜柱(zhu)是一款混合C18和強陽離子交換(huan)SCX填料的色譜柱。對多種堿性化合物進行同時分析時，能同時兼顧對保(bao)留(liu)和(he)MS檢測靈(ling)敏度的要求。
★ 強陽離子交換SCX與C18混合填料
★ 具(ju)有*分(fen)離(li)模(mo)式
★ 適合于LC-MS的高靈敏度離子化合物分(fen)析(xi)
★ 可對酸性、中性、堿性化合物進(jin)行同(tong)時保(bao)留
★ 有3種混合比例可供選(xuan)擇
*與武(wu)田制藥共同開發
通(tong)過調(diao)整流動(dong)相的鹽濃度，可在離子(zi)交換作用下(xia)針對堿(jian)性化(hua)合物的保留(liu)程(cheng)度進行調(diao)整，從而改變分(fen)離模式，達到不同極性化(hua)合物同時分(fen)析的效(xiao)果(guo)。
